传统食品微生物检测方法
+咨询 发布时间:2021-02-03
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注意:因业务调整,暂不接受个人委托测试望见谅。
传统微生物检测方法包括形态观察、生化鉴定及血清学分型等冗繁的操作,已不能满足现代食品微生物检测对灵敏度、特异性和时效性的要求。
分子生物学方法
此类方法在基因水平上对靶标微生物进行检测,尤其适用于难培养或抗原结构复杂微生物的鉴定及分型,主要包括PCR、核酸分子杂交及基因芯片等技术。
PCR及其衍生技术
PCR是一种体外酶促合成特定DNA片段的技术,它通过以变性、退火和延伸3个步骤为一个周期的循环反应实现产物的指数级增长。相对于扩增单一靶基因的常规PCR,多重PCR通过在同一反应体系中加入多对特异性引物来实现在同一反应管中同时扩增多个目标基因,可用于同时检测多种微生物或通过多基因交叉确认来进行特定微生物鉴定或种下分型。
实时荧光定量PCR技术是一种通过监测PCR产物荧光信号的实时累积来定性或定量分析起始模板的方法。该法全程封闭式反应且无需PCR后处理,避免了交叉污染及溴化乙锭等有毒物质的使用,具有特异性强、高度自动化等优点。通过选取特异性基因设计引物及探针,qRT-PCR法近年来已在多种致病细菌、霉菌、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物指标的定性和定量检测中被广泛应用。
尽管上述PCR及其衍生技术具有高灵敏度、快速等优点,但方法实施所需的昂贵仪器设备严重限制了其在我国食品检测机构的推广应用。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交是利用带有标记的特定DNA或RNA探针与已变性的待检核酸样品进行杂交,若样品中存在与探针互补的靶标序列则二者退火形成带标记的双链,通过对标记物信号有无及强度的检测即可实现微生物定性或定量分析。 分子杂交技术应用的关键在于靶标特异性核酸片段选取及相应探针设计及标记。如以葡糖苷酸酶基因设计核酸探针可用于检测食品中的总大肠杆菌,而其不同致病型的区分则需针对特异毒力基因合成适宜的探针。由于放射性标记存在标记元素的半衰期短、对人体及环境不友好以及需要特殊操作设备等缺陷,近年来已逐渐被非放射性DNA探针检测系统所取代,其主要通过酶促反应将特定的底物转变为生色物质或化学发光物质而达到信号放大的目的。
基因芯片
基因芯片又称DNA微阵列,是一种高通量的核酸分子杂交技术。它通过原位合成或显微打印将一系列探针以预设的次序固定于固相支持介质表面,形成高密度的寡核苷酸阵列,样品经核酸提取、PCR扩增及标记后与芯片上的探针阵列杂交,最后通过荧光扫描或酶学方法检测杂交信号的强度和分布以确定受检样品中特定微生物的存在及丰度。
食品中的微生物种群具有种类广、丰度低、随机性强等特点,传统的培养、鉴定方法往往会掩盖一些低丰度或不易培养的微生物,而PCR、免疫杂交等现代技术则多限于检测一种或少数几种靶标微生物或基因,难以全面分析食品受污染状况。而基因芯片具有高通量、并行化及高度自动化等优点,为食品微生物群落结构研究、食源性致病菌多个毒力、药敏基因的同步化、快速检测等提供了一个有力的平台。
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