RNA干扰敲低验证

检测项目

mRNA表达水平定量：通过qRT-PCR技术，精确测量靶基因在RNA干扰处理后的mRNA相对表达量变化，是验证敲低效率最直接和常用的方法。

蛋白质表达水平分析：利用Western Blot、免疫荧光或流式细胞术检测靶蛋白的表达丰度，从功能分子层面确认敲低效果。

细胞增殖与活力检测：通过CCK-8、MTT或细胞计数等方法，评估靶基因敲低后对细胞生长、增殖和存活率的影响。

细胞周期分布检测：使用流式细胞术分析PI染色后的细胞DNA含量，判断敲低是否引起细胞周期阻滞在特定时相。

细胞凋亡率检测：采用Annexin V/PI双染法结合流式细胞术，定量分析靶基因敲低诱导的细胞早期和晚期凋亡情况。

细胞迁移能力检测：通过划痕愈合实验，观察和测量细胞在靶基因敲低后迁移填补划痕区域的能力变化。

细胞侵袭能力检测：利用Transwell小室（包被Matrigel）实验，定量分析敲低细胞穿过基质胶屏障的能力，评估其侵袭性改变。

克隆形成能力检测：通过平板克隆形成实验，评估单个细胞在靶基因敲低后持续增殖形成细胞集落的能力。

信号通路关键分子磷酸化检测：使用磷酸化特异性抗体进行Western Blot，分析敲低是否影响下游信号通路关键蛋白的活化状态。

脱靶效应初步筛查：通过生物信息学预测及qRT-PCR验证，检查使用的siRNA/shRNA是否对非靶基因，特别是同源基因，产生了非特异性抑制。

检测范围

哺乳动物细胞系：适用于HeLa、HEK293、HepG2、MCF-7等多种已建立的人源或鼠源等哺乳动物永生化细胞系。

原代培养细胞：可用于从组织中新分离培养的原代细胞，但需考虑其转染效率较低的问题，可能需使用特殊转染试剂或病毒载体。

悬浮细胞与贴壁细胞：检测方法覆盖常见的悬浮生长细胞（如淋巴细胞、白血病细胞系）和贴壁生长细胞。

稳定敲低细胞株：适用于通过慢病毒或逆转录病毒载体构建的、稳定表达shRNA的细胞株的长期表型与机制研究。

瞬时转染模型：主要针对通过脂质体、电转等方式瞬时导入siRNA/shRNA后48-96小时内的短期敲低效果验证。

体内动物模型样本：可从经体内递送siRNA/shRNA的动物模型（如肿瘤移植瘤）中分离组织或细胞，进行离体验证。

特定亚细胞结构组分：可针对细胞核、细胞质、线粒体等特定亚细胞结构分离后的组分，检测其中靶基因产物的变化。

不同时间点动态监测：可在转染后24小时、48小时、72小时乃至更长时间点进行系列检测，观察敲低效果的动态变化和持续时间。

多种干扰试剂对比：范围涵盖对同一靶基因设计的不同序列siRNA、不同shRNA载体以及化学修饰的siRNA类似物的效果比较验证。

基因功能获得性救援实验：在敲低基础上，通过共转染不受shRNA影响的野生型或突变型靶基因cDNA，进行表型回复验证，确认特异性。

检测方法

实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）：提取总RNA并反转录为cDNA后，使用SYBR Green或TaqMan探针法进行定量PCR，通过ΔΔCt法计算mRNA敲低效率。

蛋白质免疫印迹（Western Blot）：提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE分离、转膜后，用特异性一抗和二抗检测靶蛋白条带强度，以内参蛋白标准化进行半定量分析。

免疫荧光染色与共聚焦显微镜观察：细胞固定通透后，用荧光标记的特异性抗体染色靶蛋白，在共聚焦显微镜下观察其亚细胞定位及表达强度的变化。

流式细胞术分析：适用于对细胞内蛋白（需固定破膜）或表面蛋白进行荧光抗体标记，快速统计大量细胞中蛋白表达量的分布及平均荧光强度。

CCK-8法细胞活力检测：在细胞培养中加入水溶性的CCK-8试剂，活细胞线粒体脱氢酶将其还原为橙色甲臜产物，通过酶标仪测定吸光度来反映细胞活力。

Annexin V-FITC/PI双染流式检测凋亡：利用磷脂酰丝氨酸外翻（Annexin V结合）和膜完整性丧失（PI摄入）区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞。

划痕愈合实验：在单层贴壁细胞上制造一个无细胞的“划痕”，定期在显微镜下拍照并测量划痕宽度，计算细胞迁移率。

Transwell侵袭实验：将Matrigel铺于Transwell上室膜上，模拟基底膜，下室加趋化因子，计数穿过胶和膜进入下室的细胞数，评估侵袭能力。

平板克隆形成实验：将低密度接种的单个细胞培养1-2周，经固定染色后，计数肉眼可见的、由超过50个细胞组成的克隆数。

高通量测序验证脱靶效应：通过转录组测序（RNA-seq）全面比较处理组与对照组的基因表达谱，系统性地分析与预测潜在的脱靶基因。

检测仪器设备

实时荧光定量PCR仪：用于执行qRT-PCR反应，能够实时监测荧光信号并生成扩增曲线与熔解曲线，是定量mRNA的核心设备。

垂直电泳槽与电源：用于进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，根据分子量大小分离复杂的蛋白质混合物。

半干转或湿转转膜仪：将凝胶中分离的蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上，以便进行后续的免疫检测。

化学发光成像系统：用于捕获Western Blot膜上经ECL等化学发光底物反应后产生的光信号，对蛋白条带进行成像和光密度定量分析。

倒置荧光显微镜及共聚焦显微镜：倒置荧光显微镜用于观察免疫荧光染色样本；共聚焦显微镜可获得更高分辨率、光学切片的三维图像。

流式细胞仪：能够快速、多参数地分析悬浮液中单个细胞的物理和化学特性，用于检测蛋白表达、细胞周期、凋亡等。

多功能酶标仪：具备吸收光、荧光和化学发光等多种检测模式，用于读取CCK-8、MTT、荧光染料等的信号值，实现高通量检测。

CO2恒温细胞培养箱：提供稳定的温度（37℃）、湿度和CO2浓度（通常5%）环境，用于所有活体细胞的培养和维持。

生物安全柜/超净工作台：提供无菌操作环境，用于细胞的传代、接种、转染以及添加试剂等所有需要无菌条件的操作。

低温高速离心机与微量分光光度计：离心机用于沉淀细胞、收集蛋白或核酸；分光光度计用于快速测定RNA、DNA及蛋白样品的浓度和纯度。

检测服务范围

1、指标检测：按国标、行标及其他规范方法检测

2、仪器共享：按仪器规范或用户提供的规范检测

3、主成分分析：对含量高的组分或你所规定的某种组分进行5~7天检测。

4，样品前处理：对产品进行预处理后，进行样品前处理，包括样品的采集与保存，样品的提取与分离，样品的鉴定以及样品的初步分析，通过逆向剖析确定原料化学名称及含量等共10个步骤;

5、深度分析：根据成分分析对采购的原料标准品做准确的定性定量检测，然后给出参考工艺及原料的推荐。最后对产品的质量控制及生产过程中出现问题及时解决。

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