多重扩增均衡性实验

检测项目

引物特异性评估：检验多重PCR体系中各对引物是否仅针对其目标区域进行特异性扩增，避免非特异性结合。

扩增效率一致性：衡量不同目标基因或基因组区域在同一个多重PCR反应中扩增速率和最终产量的相似程度。

产物覆盖均匀度：评估测序后，各目标区域 reads 覆盖深度的分布情况，是衡量均衡性的直接指标。

等位基因脱扣（ADO）检测：在杂合子位点检测其中一个等位基因未能有效扩增的现象，对遗传病诊断至关重要。

交叉反应与二聚体形成：检测不同引物对之间是否存在相互作用，形成引物二聚体或非目标扩增产物。

模板投入量线性响应：验证在不同起始模板量下，各目标区域的扩增产量是否保持线性关系。

GC含量偏差分析：分析目标区域GC含量对扩增效率的影响，高GC或低GC区域常出现扩增偏差。

批次间重复性：评估同一实验方案在不同时间、不同操作者或不同试剂批次下结果的稳定性和可重复性。

阳性与阴性对照符合率：通过已知阳性和阴性样本验证实验体系的准确性与特异性。

最低检测限（LoD）确定：确定该多重扩增体系能够稳定检出目标序列的最低模板拷贝数或浓度。

检测范围

多基因panel测序：适用于癌症基因、遗传病基因等定制化多基因组合的扩增均衡性评估。

全外显子组捕获后扩增：对全外显子组捕获后的富集片段进行扩增时，评估其覆盖均一性。

液态活检ctDNA检测：针对血液中痕量循环肿瘤DNA（ctDNA）的多重扩增，评估其对低频突变的检测能力。

病原体多重检测：用于同时检测多种病毒、细菌或真菌病原体核酸的扩增体系均衡性验证。

线粒体基因组测序：评估线粒体DNA全基因组或特定区域多重扩增的覆盖完整性。

HLA分型与基因定型：在高度多态性的人类白细胞抗原（HLA）基因分型中，确保各等位基因均衡扩增。

拷贝数变异（CNV）分析：通过均衡的多重扩增来精确检测基因组片段的拷贝数增加或缺失。

单细胞全基因组扩增：评估基于多重置换扩增（MDA）等方法的单细胞DNA扩增均匀性。

微生物组靶向测序：如16S rRNA或JianCe区域扩增，评估其对不同菌种代表性的保持能力。

法医学STR分型：验证多个短串联重复序列（STR）位点在复合扩增中的效率一致性，确保分型准确。

检测方法

高通量测序法：通过下一代测序（NGS）直接获取各扩增区域的 reads 数，计算覆盖深度和变异系数（CV）。

微流控芯片数字PCR：利用数字PCR的绝对定量能力，精确定量多重体系中每个靶标的分子数，计算扩增效率。

荧光定量PCR（qPCR）：对多重PCR产物中的单个靶标进行特异性TaqMan探针或SYBR Green qPCR验证，比较Ct值。

毛细管电泳法：使用片段分析仪对扩增产物进行分离和荧光强度检测，通过峰高或峰面积评估产量均衡性。

生物分析仪/片段分析仪检测：利用Agilent Bioanalyzer或Fragment Analyzer等设备分析产物片段分布和浓度。

杂交捕获效率评估：对于涉及杂交捕获步骤的流程，通过qPCR分别测定捕获前后特定区域的含量来计算捕获效率均一性。

Sanger测序验证法：对疑似存在扩增偏差的特定区域进行Sanger测序，作为NGS结果的补充验证。

标准品梯度稀释法：使用已知浓度和组成的标准品（如标准基因组DNA、人工合成DNA混合物）进行系列稀释测试。

生物信息学统计分析：采用专业的生信工具（如Picard、GATK、自定义脚本）计算覆盖深度的均值、中位数、CV值及分布图。

内参基因归一化法：在多重体系中引入已知拷贝数的内参基因或外源spike-in对照，用于校正样本间的差异。

检测仪器设备

高通量测序仪：如Illumina NovaSeq、MiSeq， Ion Torrent S5等，是评估最终覆盖均衡性的核心设备。

实时荧光定量PCR仪：如ABI QuantStudio系列、Bio-Rad CFX系列，用于精确测定扩增动力学和效率。

数字PCR系统：如Bio-Rad QX200、Thermo Fisher QuantStudio 3D，提供绝对定量数据用于精准校准。

微流控片段分析系统：如Agilent 2100 Bioanalyzer、Fragment Analyzer，快速分析扩增产物的片段大小和浓度分布。

毛细管电泳遗传分析仪：如ABI 3500系列，用于STR分型或PCR产物片段分析的经典设备。

核酸定量仪：如Qubit荧光计、NanoDrop分光光度计，精确测定起始模板及产物的浓度。

PCR扩增仪：具备良好温度均一性和控温精度的热循环仪，是进行稳定多重PCR反应的基础。

自动化液体处理工作站：如Hamilton STAR、Tecan Freedom EVO，减少人工操作误差，提高实验重复性。

生物信息学分析服务器/集群：配备高性能CPU和大内存的计算平台，用于处理和分析海量测序数据。

超微量核酸蛋白检测仪：如Agilent TapeStation，可高通量自动化进行样本质量控制和定量。

检测服务范围

1、指标检测：按国标、行标及其他规范方法检测

2、仪器共享：按仪器规范或用户提供的规范检测

3、主成分分析：对含量高的组分或你所规定的某种组分进行5~7天检测。

4，样品前处理：对产品进行预处理后，进行样品前处理，包括样品的采集与保存，样品的提取与分离，样品的鉴定以及样品的初步分析，通过逆向剖析确定原料化学名称及含量等共10个步骤;

5、深度分析：根据成分分析对采购的原料标准品做准确的定性定量检测，然后给出参考工艺及原料的推荐。最后对产品的质量控制及生产过程中出现问题及时解决。

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