内参基因验证测试

检测项目

候选内参基因筛选：基于文献调研与数据库分析，初步筛选出在特定实验条件下表达可能稳定的多个候选基因。

RNA完整性评估：通过电泳或芯片分析，确认用于验证测试的RNA样本无降解，质量符合要求。

引物特异性验证：通过琼脂糖凝胶电泳和熔解曲线分析，确保针对每个候选内参基因的引物扩增产物单一且无引物二聚体。

扩增效率测定：利用标准曲线法，精确计算每个候选内参基因引物的PCR扩增效率，理想范围在90%-110%之间。

表达丰度检测：定量检测各候选基因在不同样本中的Ct值，评估其表达水平，避免选择过高或过低表达的基因。

表达稳定性分析：运用geNorm、NormFinder或BestKeeper等专业算法，评估候选基因在不同实验组间的表达稳定性。

最优内参基因数目确定：根据配对变异值分析，确定用于标准化所需的最适内参基因数量，通常推荐使用两个或以上。

组织/细胞特异性验证：检验候选内参基因的表达是否在不同组织类型或细胞系中均保持稳定。

实验处理干扰评估：验证候选内参基因的表达是否受药物处理、病理状态、发育阶段等实验因素影响。

最终验证与应用：将筛选出的最优内参组合应用于目标基因的定量分析，并通过实验验证其标准化效果的有效性。

检测范围

不同物种样本：适用于人类、小鼠、大鼠、植物、微生物等多种生物体的组织或细胞样本。

多种组织类型：涵盖心脏、肝脏、脑、肾脏、肿瘤组织、脂肪组织等各类器官与组织样本。

各类细胞系：包括原代细胞、传代细胞系、干细胞以及经过不同方式转染或编辑的工程化细胞。

不同病理状态样本：适用于疾病模型组织、临床病理标本（如癌与癌旁组织）与正常对照样本的对比研究。

发育阶段样本：涵盖胚胎期、幼年期、成年期及衰老期等不同发育阶段的生物样本。

药物或刺激处理样本：适用于经化学药物、物理因素（如辐射）、生物因子（如细胞因子）处理后的实验样本。

不同RNA类型：主要针对总RNA，也可延伸至mRNA、miRNA等特定RNA类型的分析。

低丰度样本：适用于RNA起始量有限的珍贵样本，如激光显微切割样本、循环游离RNA等。

高通量测序验证：将qPCR验证结果与转录组测序数据关联，在组学层面确认内参基因的稳定性。

标准化流程建立：为特定研究领域或实验体系建立一套标准化的内参基因使用与验证流程。

检测方法

TRIzol法提取总RNA：使用经典的酚-氯仿异戊醇法从组织或细胞中提取高质量的总RNA。

柱式离心法纯化RNA：利用硅胶膜吸附原理，快速纯化RNA，有效去除基因组DNA、蛋白质等杂质。

微量分光光度法：使用NanoDrop等仪器测定RNA浓度并评估其纯度（A260/A280及A260/A230比值）。

琼脂糖凝胶电泳法：通过电泳条带观察28S/18S rRNA的亮度比及条带完整性，直观判断RNA是否降解。

逆转录PCR（RT-PCR）：以Oligo dT、随机引物或基因特异性引物将RNA逆转录为cDNA第一链。

实时荧光定量PCR（qPCR）：采用SYBR Green I染料法或TaqMan探针法，对候选内参基因进行定量扩增。

标准曲线法：将已知浓度的模板进行系列稀释并扩增，绘制Ct值与模板浓度的对数之间的标准曲线。

熔解曲线分析：在qPCR结束后进行升温溶解，通过分析熔解峰的单峰特性来确认扩增产物的特异性。

生物信息学算法分析：应用geNorm、NormFinder等软件，基于qPCR的Ct值数据计算基因表达的稳定性值（M值）。

相对定量ΔΔCt法：利用已验证的内参基因对目标基因的表达量进行归一化处理，计算相对表达变化。

检测仪器设备

微量分光光度计（如NanoDrop）：用于快速、微量地测定核酸样本的浓度和纯度，仅需1-2μL样本。

琼脂糖凝胶电泳系统：包括电泳槽、电源和凝胶成像系统，用于评估RNA完整性和PCR产物大小。

高速冷冻离心机：用于RNA提取过程中样本的低温高速离心，以分离不同相态的液体和沉淀核酸。

PCR仪（热循环仪）：用于完成逆转录反应以及常规的PCR扩增反应，提供精确的温度控制。

实时荧光定量PCR仪（如ABI QuantStudio）：核心设备，能够在PCR循环过程中实时监测荧光信号，实现精确定量。

超净工作台/生物安全柜：提供无菌操作环境，防止RNA酶污染和样本间的交叉污染，保障RNA操作安全。

-80℃超低温冰箱：用于长期保存提取的RNA、cDNA等珍贵生物样本，确保其稳定性。

涡旋振荡器与微量移液器：前者用于充分混匀反应体系；后者是精确移取微量液体的关键工具。

核酸浓度测定仪（如Qubit）：基于荧光染料特异性结合的原理，比吸光度法更精确地测定低浓度或微量核酸样本的浓度。

生物分析仪（如Agilent 2100）：通过微流控芯片技术提供RNA完整性数值（RIN值），对RNA质量进行数字化精准评估。

检测服务范围

1、指标检测：按国标、行标及其他规范方法检测

2、仪器共享：按仪器规范或用户提供的规范检测

3、主成分分析：对含量高的组分或你所规定的某种组分进行5~7天检测。

4，样品前处理：对产品进行预处理后，进行样品前处理，包括样品的采集与保存，样品的提取与分离，样品的鉴定以及样品的初步分析，通过逆向剖析确定原料化学名称及含量等共10个步骤;

5、深度分析：根据成分分析对采购的原料标准品做准确的定性定量检测，然后给出参考工艺及原料的推荐。最后对产品的质量控制及生产过程中出现问题及时解决。

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