蛋白质印迹相互作用验证

检测项目

免疫共沉淀（Co-IP）验证：利用特异性抗体捕获靶蛋白及其相互作用的蛋白复合物，通过WB验证相互作用的存在。

GST Pull-down实验：将一种蛋白与GST标签融合表达并固化在谷胱甘肽珠上，用于从溶液“下拉”与之相互作用的蛋白。

His Pull-down实验：利用组氨酸标签与镍/钴等金属离子的亲和力，纯化并验证蛋白间的相互作用。

Flag/HA等标签蛋白Pull-down：使用Flag、HA等常见标签及其对应抗体偶联的琼脂糖珠进行亲和纯化与验证。

内源性蛋白相互作用验证：在不进行过表达的情况下，直接验证细胞或组织中天然存在的蛋白复合物。

过表达蛋白相互作用验证：通过转染使目标蛋白在细胞内过表达，以增强信号，验证其相互作用。

磷酸化依赖的相互作用验证：研究蛋白质磷酸化修饰状态对其与其他蛋白结合能力的影响。

竞争性结合实验：通过加入潜在竞争分子，验证相互作用的特异性及结合位点。

结构域-结构域相互作用定位：通过构建不同截短体，确定介导相互作用的特定蛋白结构域。

膜蛋白与胞质蛋白相互作用：验证跨膜受体与下游信号蛋白等跨膜区蛋白间的特异性结合。

检测范围

信号转导通路蛋白复合物：验证激酶、磷酸酶、衔接蛋白等在信号通路中的直接相互作用。

转录因子与辅因子：研究转录调控复合物中DNA结合蛋白与其他调节蛋白的互作。

细胞骨架相关蛋白互作：验证肌动蛋白、微管等骨架蛋白与其结合蛋白间的相互作用网络。

泛素化/SUMO化酶与底物：鉴定E3连接酶与其特异性底物蛋白之间的直接结合。

受体与配体结合验证：确认细胞表面受体与其可溶性配体或膜结合配体的相互作用。

病毒/病原体蛋白与宿主蛋白：研究感染过程中病原体蛋白劫持或干扰宿主细胞蛋白的机制。

药物靶点与效应蛋白：筛选和验证小分子药物候选靶点与其细胞内效应蛋白的结合。

抗体-抗原特异性识别：在非变条件下验证单克隆/多克隆抗体与目标抗原的特异性结合。

酶与底物/抑制剂相互作用：在非催化条件下验证酶与其底物或抑制剂的稳定结合。

染色质修饰蛋白复合物：验证组蛋白修饰酶、阅读器、擦除器等在染色质重塑复合物中的互作。

检测方法

细胞裂解与样品制备：使用温和的非变性裂解液（如NP-40裂解液）保持蛋白相互作用的完整性。

抗体-珠子偶联与预处理：将特异性抗体共价或非共价偶联到Protein A/G或琼脂糖珠上，并进行封闭以减少非特异性吸附。

免疫沉淀（IP）反应：将偶联抗体的珠子与细胞裂解液共孵育，使目标蛋白及其互作蛋白被特异性捕获。

珠子洗涤：使用裂解缓冲液进行多次严格洗涤，去除未结合和非特异性结合的杂蛋白。

洗脱与样品变性：使用低pH洗脱液或直接加入SDS-PAGE上样缓冲液并煮沸，将复合物从珠子上洗脱并变性。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：根据目标蛋白分子量选择合适浓度的凝胶，将样品进行分离。

蛋白质转膜：采用湿转或半干转法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF或NC膜上。

膜封闭：使用5%脱脂牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景信号。

抗体孵育与显影：依次孵育针对互作蛋白的一抗和带标记的二抗，最后通过化学发光（ECL）等方法显影。

结果分析与对照设置：必须设置输入（Input）、阴性对照（IgG对照）和空载体/突变体对照以确保结果特异性。

检测仪器设备

低温高速离心机：用于样品制备、沉淀反应后收集珠子以及分离细胞组分。

垂直板电泳系统：用于进行SDS-PAGE，分离不同分子量的蛋白质样品。

湿转或半干转印系统：将凝胶中分离的蛋白质高效、均匀地转移至固相支持膜上。

化学发光成像系统：高灵敏度检测并记录ECL等发光信号，进行蛋白质条带的定性和半定量分析。

摇床/旋转仪：用于免疫沉淀反应、膜封闭及抗体孵育过程中的温和混匀。

恒温培养箱/水浴锅：用于细胞培养、细菌培养以制备重组蛋白，以及样品加热变性。

微量移液器与枪头：精确移取微量液体，是实验操作中最基础且关键的设备。

分析天平与pH计：精确称量试剂和配制各种缓冲液，确保溶液pH准确。

-80°C/-20°C冰箱：长期或短期保存细胞、组织样品、裂解液、抗体及各种试剂。

超纯水系统：提供无离子、无核酸酶/蛋白酶污染的纯水，用于配制所有溶液和清洗器具。

检测服务范围

1、指标检测：按国标、行标及其他规范方法检测

2、仪器共享：按仪器规范或用户提供的规范检测

3、主成分分析：对含量高的组分或你所规定的某种组分进行5~7天检测。

4，样品前处理：对产品进行预处理后，进行样品前处理，包括样品的采集与保存，样品的提取与分离，样品的鉴定以及样品的初步分析，通过逆向剖析确定原料化学名称及含量等共10个步骤;

5、深度分析：根据成分分析对采购的原料标准品做准确的定性定量检测，然后给出参考工艺及原料的推荐。最后对产品的质量控制及生产过程中出现问题及时解决。

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