肿瘤组织EGFR外显子19缺失分析

检测项目

样本接收与登记：接收来自病理科的肿瘤组织样本（如石蜡包埋组织、新鲜组织等），并进行唯一标识和信息核对登记。

病理学评估：由病理医师对送检组织切片进行显微镜下评估，确认肿瘤细胞含量及质量是否满足分子检测要求。

核酸提取：从经评估合格的肿瘤组织中提取基因组DNA，确保DNA的纯度和浓度满足后续检测需求。

DNA质量与浓度定量：使用微量分光光度计或荧光定量仪对提取的DNA进行浓度和纯度（如A260/A280比值）的精确测定。

EGFR外显子19区域扩增：通过聚合酶链式反应（PCR）特异性扩增包含外显子19在内的目标DNA片段。

PCR产物纯化：去除PCR反应体系中的引物、dNTPs、酶等杂质，纯化目标扩增产物，为后续测序或分析做准备。

测序文库构建：将纯化后的PCR产物进行末端修复、加接头等步骤，构建成适用于高通量测序平台的文库。

序列测定：采用Sanger测序或高通量测序技术，对EGFR基因外显子19区域进行双向测序，获取原始序列数据。

序列比对与分析：将测得的序列与人类基因组参考序列进行比对，识别是否存在缺失突变及其具体类型。

报告生成与审核：根据分析结果生成检测报告，详细描述突变状态，并由授权人员审核签发，为临床用药提供依据。

检测范围

经典缺失delE746-A750：检测外显子19第746-750位氨基酸密码子（对应基因组核苷酸序列缺失15个碱基）的经典缺失突变。

其他框内缺失变异：检测除经典缺失外，其他导致EGFR蛋白第19外显子区域氨基酸缺失但不引起移码的多种缺失类型。

点突变伴随缺失：检测在缺失区域内或边界同时伴随发生的单核苷酸点突变，这些复合突变可能影响TKI药物的敏感性。

复杂插入/缺失：检测涉及EGFR外显子19区域的、序列缺失与插入同时存在的复杂基因变异。

罕见缺失类型：检测发生频率较低、非典型的缺失模式，确保检测方法的广谱性。

肿瘤细胞突变丰度：在可能的情况下，通过数字PCR或深度测序等方法，定量检测突变等位基因在肿瘤细胞中的比例。

样本交叉污染监控：通过设置阴性对照，监控实验过程中可能出现的样本间交叉污染，确保结果特异性。

内参基因完整性评估：同时检测样本中管家基因，以评估提取的DNA是否发生降解，确保检测结果的可靠性。

药物相关突变位点覆盖：确保检测范围覆盖所有与第一、二、三代EGFR-TKI药物疗效预测相关的外显子19缺失亚型。

质控品检测：包含已知突变阳性和野生型阴性质控品，监控从核酸提取到结果分析全流程的准确性与稳定性。

检测方法

Sanger测序法：传统的直接测序金标准方法，通过双脱氧链终止法对PCR产物进行测序，准确读取序列，但灵敏度相对较低。

实时荧光定量PCR法：使用特异性引物和探针（如ARMS法），通过检测荧光信号扩增来判定特定缺失类型，快速且灵敏度高。

高通量测序法：基于下一代测序技术，可一次性平行检测大量样本的多个基因多位点，包括所有已知和未知的缺失类型。

数字PCR法：将样本分割成数万个微反应单元进行PCR，通过泊松分布原理进行绝对定量，具有极高的灵敏度和准确性。

片段分析毛细管电泳法：通过PCR扩增后，利用毛细管电泳分析产物片段大小，与野生型对照比较，可快速筛查缺失突变。

焦磷酸测序法：一种基于酶联化学发光的定量测序技术，适用于对已知缺失热点区域进行快速、准确的序列分析。

多重连接依赖性探针扩增技术：用于检测基因拷贝数变化，也可应用于特定外显子缺失的筛查。

基于质谱的基因分型：将PCR扩增与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术结合，实现高通量、多位点的突变检测。

免疫组织化学法（针对特定缺失）：使用针对特定缺失突变蛋白表位的抗体进行染色，作为初筛或补充手段，但并非直接检测DNA。

微滴式数字PCR法：数字PCR的一种具体实现方式，利用油包水微滴技术，是目前检测低丰度突变和微小残留病的先进方法。

检测仪器设备

病理切片扫描仪：用于将组织切片数字化，便于远程病理评估和肿瘤区域圈定。

组织研磨仪/匀浆仪：用于将石蜡包埋或新鲜肿瘤组织进行物理破碎，以充分释放细胞及核酸。

核酸自动提取仪：自动化完成细胞裂解、核酸结合、洗涤和洗脱等步骤，提高提取效率与一致性。

微量分光光度计：基于紫外吸收原理，快速测定微量DNA样本的浓度和纯度。

荧光定量PCR仪：进行实时荧光定量PCR检测的核心设备，可实时监测扩增过程中的荧光信号变化。

普通PCR仪：用于常规的DNA模板扩增，为Sanger测序、文库构建等步骤提供产物。

Sanger测序仪：基于毛细管电泳分离和荧光检测，用于对PCR产物进行一代测序分析。

高通量测序仪：如Illumina、Ion Torrent等平台，实现大规模并行测序，是NGS检测的核心设备。

数字PCR系统：包括微滴生成仪、PCR扩增仪和微滴读取仪，用于实现绝对定量的数字PCR检测。

生物分析仪/片段分析仪：利用微流控芯片技术，精确分析DNA片段大小、浓度及完整性，用于文库质控。

检测服务范围

1、指标检测：按国标、行标及其他规范方法检测

2、仪器共享：按仪器规范或用户提供的规范检测

3、主成分分析：对含量高的组分或你所规定的某种组分进行5~7天检测。

4，样品前处理：对产品进行预处理后，进行样品前处理，包括样品的采集与保存，样品的提取与分离，样品的鉴定以及样品的初步分析，通过逆向剖析确定原料化学名称及含量等共10个步骤;

5、深度分析：根据成分分析对采购的原料标准品做准确的定性定量检测，然后给出参考工艺及原料的推荐。最后对产品的质量控制及生产过程中出现问题及时解决。

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